数字PCR｜使用液滴数字聚合酶链反应检测微小残留疾病:一项前瞻性多机构研究

摘要

液滴数字聚合酶链反应(ddPCR)是一种准确测定核酸的方法。本前研究的目的是利用ddPCR评价慢性髓系白血病(CML)患者的微小残留病(MRD)。患者及方法：2013年5月至2014年11月，采用尼洛替尼治疗的CML患者被纳入研究。在第一次*分子反应(CMR)时使用ddPCR评估BCR/ABL1转录本水平。我们招募了来自7个机构的15名患者。治疗期为45个月和47个月。结果：高水平BCR/ABL1转录本的患者在随访期间更容易失去CMR (p=0.095)。此外，BCR/ABL1转录水平低的患者与高水平患者相比，CMR持续时间更长(p=0.032)。结论:ddPCR是一种灵敏的检测MRD的方法，MRD可影响治疗反应持续时间。

慢性髓系白血病(CML)的细胞遗传学特征是t(9;22)(q34;q11.2)，产生BCR/ABL1融合癌基因。自人类第一种靶向药物伊马替尼成功以来，更有效的酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)，如达沙替尼和尼洛替尼被引入CML的一线治疗，并显示76~82%的主要分子应答率。CML现在被认为是一种终身疾病，5年总生存率>90%。以前的报道已经证明，早期分子反应的实现是改善预后的一个强有力的预测指标。因此，欧洲白血病网指南建议的最佳响应百分比BCR/ ABL1融合转录本在国际规模(BCR / ABL1) < 10%，初始治疗后3个月，紧随其后的是<1%，6个月和12个月，0.1%使用定量实时聚合酶链反应(qRTpcr)。此外，最近的证据表明，深度分子反应(DMR)的成就，包括MR4 (BCR/ABL1 IS≤0.01%)或MR4.5 (BCR/ABL1IS≤0.0032%)，是良好生存和无治疗缓解的替代标志。选择达到DMR的患者可以尝试停用TKIs，以改善他们的生活质量和缓解经济压力。虽然qRT-PCR通常用于常规监测，但需要额外的敏感方法来检测微小残留疾病(MRD)。摘要液滴数字聚合酶链反应(ddPCR)可对核酸进行精确定量。由于其阳性结果，它已被用于检测血液病的MRD。在CML中，ddPCR已被验证用于精确测量BCR/ABL1融合转录本。我们假设，与传统的qRT-PCR相比，ddPCR在检测DMR患者的癌转录本水平方面更敏感。因此，本研究的目的是利用ddPCR对尼洛替尼治疗的CML患者进行MRD评价，这些患者首先通过qRT- PCR获得了*分子反应(CMR)。我们还评估了ddPCR阳性与患者预后的关系。

患者及方法患者特点：

从2013年5月到2014年11月，我们前瞻性地纳入了费城染色体(Ph)阳性CML慢性期患者，这些患者在尼洛替尼治疗期间获得了CMR。所有患者均采用尼洛替尼300 mg，每日2次作为一线靶向治疗。纳入和排除标准与开放标签、多机构4期ENESTKorea试验相同。本研究包括被诊断为ph阳性慢性粒细胞白血病的成年患者。在入组前6个月内，通过至少20个骨髓中期细胞的细胞遗传学分析证实了诊断。排除标准如下：i)非典型BCR/ABL1转录本的CML(转录本不包括e13a2或e14a2，ii)既往使用骨髓抑制药物治疗(羟基脲和阿纳格列德除外)，iii)既往使用TKI治疗超过两周，iv)既往造血干细胞移植，v)既往放疗涉及25%或以上骨髓组织，vi)细胞病理证实CML中枢神经系统受累，vii)东部合作肿瘤组表现状态≥3 (12)，viii)心脏异常，包括：a)纠正心电图QT间期≥480毫秒，b)*左束支传导阻滞，c)forever性起搏器植入，d)先天性长QT综合征，e)需要治疗的快速心律失常病史，f)临床上显著的静息性心动过缓，g) 12个月内有急性冠脉综合征病史，h)失代偿性充血性心力衰竭，ix)器官功能障碍，定义为：a)血清总胆红素水平≥1.5×正常范围上限(ULN)，b)肌酐≥1.5×ULN，c)天冬氨酸或丙氨酸转氨酶≥2.5×ULN，d)淀粉酶或脂肪酶≥1.5×ULN，e)碱性磷酸酶≥2.5×ULN，与CML无直接关系，x) CML以外的活性和未受控制的恶性肿瘤，xi)高血压或糖尿病未控制，xii)感染活跃且未控制，xiii)两周内接受大手术或前一次手术未*恢复，xiv)先天性或获得性出血倾向，xv)胃肠吸收受损，xvi)小肠切除或搭桥手术史，xvii) 12个月内有急性胰腺炎或慢性胰腺炎病史，xviii)同时服用强而不可替代的CYP3A4抑制剂或诱导性药物、QT延长剂或XDS衍生物，xix)任何其他不受控制的医疗状况，可能存在重大的安全风险或危及研究治疗的依从性。在入选ENESTKorea试验的患者中，我们选择了随访期间获得CMR的患者，在他们F获得CMR时，我们可以使用ddPCR评估BCR/ABL1融合转录本的水平。通过qRT-PCR将CMR定义为不可检测的BCR/ABL1转录水平。随访期间，对所有患者进行评估，每3个月在中心实验室(韩国大田BML)进行qRT -PCR，量化BCR/ABL1融合转录本，并将其标准化为BCR/ABL1 ^IS。本研究采用ENESTKorea试验的qRT-PCR方案。本研究使用的qRT -PCR的灵敏度为MR ^4.5。通过各机构的医疗记录审查收集临床信息，包括患者人口特征、BCR/ABL1融合转录本水平和不良反应(AEs)。

BCR/ABL1融合转录本水平测定-定量RT- PCR分析mRNA水平。根据制造商的说明书，使用SuperScript®III first-strand Synthesis (Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)将分离的总RNA逆转录为第一链cDNA。最终反应体积为20 μl，加入总RNA1 μg。反应混合物在50˚C孵育50分钟，然后加热至85˚C5分钟停止反应，然后在-20˚C保存至下一步。逆转录后，以逆转录反应的2 μl为模板，进行BCR/ABL1和BCR扩增。使用SsoAdvanced™UniversalSYBR®Green Supermix (Bio Rad, Hercules, CA, USA)和CFX384Real- Time System thermocycler (伯乐)在总容积为15 μL的条件下进行PCR。放大曲线包括在95˚C变性30s，1个循环，然后在95˚C变性15s，然后在65˚C退火和延伸30s，45个循环。PCR完成后，使用熔化曲线分析检测BCR/ABL1和BCR的扩增模式。以每个样本的阈值循环数(C_T)确定拷贝数，并与每个重组质粒(包括BCR或BCR/ABL1扩增区)的7个不同拷贝数(从10⁶到10⁰拷贝)生成的相应标准曲线进行比较。BCR/ABL1的引物为5' -GATGCTGACCAACTCGTGTG-3 '为正向引物，5 ' -AACGAAAAGGTTGGGGTCA T-3 '为反向引物。BCR的引物为5 ' -TTCTGGACCACCTGAAAAGG-3 '为正向引物，5 ' -GCTCTGTCTCTTGCTGTCC-3 '为反向引物。

微滴体系。ddPCR的总体积为20 μl，包含10μl EvaGreen supermix (2×，伯乐)，每个引物(最终浓度为150nM)，无DNase/ Rnase无菌水，以及不同体积稀释的cDNA(40、20或5ng)实现更高的灵敏度并定义阈值。引物序列如下，BCR正向引物：5 ' -TTC TGG ACC ACC TGA AAA GG-3 '，BCR反向引物：5' -TGC TCT GTC TCT TGC TGT CC-3 '，BCR/ABL1正向引物：5 ' -GA T GCT GAC CAA CTC GTG TG-3'，BCR/ABL1反向引物：5 ' -AAC GAA AAG GTT GGG GTC A T-3'。将每个ddPCR混合物装入DG8液滴产生器(伯乐)的每个样品孔中，然后将70μl EvaGreen (伯乐)的液滴产生油装入DG8液滴产生器的每个油槽中。加药槽被放置在QX200液滴发生器(伯乐)中。当液滴生成完成时，每口液滴槽中大约生成20,000个液滴。每个液滴孔中的液滴转移到96孔PCR板(伯乐)上，使用PX1PCR板封口器(伯乐)在180℃下密封5s，然后进行热循环。PCR板置于C1000Touch扩增仪(伯乐)中进行扩增。热循环条件为：i)在95˚C下5min，ii)在95˚C下变性30s，40次循环，iii)在58˚C下退火1min，iv)在4˚C下5min，v)90˚C下5min，vi) 4˚C无限保持。所有PCR步骤均以2˚C/s的变化进行。无模板对照和阳性对照(由K562总RNA合成的cDNA)均包含在每项检测中。

数字PCR。在热循环之后，将包含液滴的PCR板加载到QX200液滴读取器(伯乐)上，使用多像素光子计数器识别evgreen荧光团的每个液滴的荧光强度。这种检测器读取液滴，通过逐滴绘制荧光图来识别那些包含(+)或不包含(-)目标基因的液滴。我们只对荧光水平与背景荧光水平有显著差异的样本确定液滴为阳性液滴。我们使用QuantaSoft 1.7.4版本软件(伯乐)测定靶基因的浓度，以copies/ μl为单位。

统计分析。分类变量的比较使用Fisher精确检验。采用Kaplan-Meier法分析治疗反应期。CMR持续时间定义为qRT-PCR检测不到BCR/ABL1转录本(BCR/ABL1 ^IS =0%)的时间。MR ^4.5的持续时间定义为从F未检测到BCR/ALB1(即ddPCR进行当天)到qRT-PCR检测到MR ^4.5缺失(BCR/ABL1 IS =0.0032%)的时间。BCR/ALB1转录本水平的临界值是使用40、20或5ng RNA测量的BCR/ABL1转录本总水平的中位数(3.6拷贝/20μL)(表II)。研究议定书经7家医院的机构审查委员会审查和批准，符合《赫尔辛基生物医学研究宣言》确立的原则。所有患者均知情同意纳入本研究。

结果

患者特点。2013年5月至2014年11月，来自7家机构的15例患者符合纳入标准(图1和表I)。共有110例患者的中位随访时间为22.7个月(范围为0.1~54.2个月)，80例患者的中位随访时间为未达到CMR，分别为22.5个月(范围=0.1~37.0个月)。15例纳入研究的患者中位随访时间为47个月(39~61个月)。所有患者均接受尼洛替尼开始剂量300mg，每日2次。中位患者年龄56岁(范围=38~83岁)。男性10例(66.7%)，女性5例(33.3%)。

表Ⅰ.患者基线特征(n=15)

表Ⅱ.在IS0%时，ddPCR检测BCR/ABL1转录水平。

ddPCR：液滴数字聚合酶链反应，IS是：国际标准。

ddPCR检测。我们测量了水平的BCR/ABL1和BCR记录三次使用ddPCR CMR首先实现时，所验证中存在的中间值(表2)。总BCR/ABL1和BCR转录水平3.6拷贝/20μl(范围= 1.2 ~6.8拷贝/20μl)和15758拷贝/20μl(范围=1802~34140循环/20μl)。

ddPCR结果和治疗结果。15例患者的中位治疗和随访时间分别为45个月(37~55个月)和47个月(39~61个月)。除了一个病人改用伊马替尼由于尼洛替尼引起的心血管事件而开始使用尼洛替尼37个月后，14例患者继续接受尼洛替尼治疗。随访期间，所有患者均维持较大的分子反应(BCR/ABL1^IS≤0.1%)。15例患者中，2例患者在随访期间失去CMR。1例患者持续CMR超过21.3个月后失去CMR, qRT-PCR检测出0.002%的BCR/ABL1。另1例患者CMR丢失，维持20.5个月后BCR/ABL1检测率为0.012%。然而，在最后的随访期间，他们没有失去MMR(一个病人9个月，另一个病人在失去CMR后8个月)。在随后的分析中，我们使用总BCR/ABL1转录水平的中位数(3.6拷贝/20μl)作为临界值。虽然高水平(>3.6拷贝/20μl)BCR/ABL1转录本的患者在随访期间有失去CMR的倾向，但低水平(0/10,0%)和高水平(2/5,40%)患者之间的CMR损失没有显著差异(p=0.095;表III)。通过ddPCR测量，低水平BCR/ABL1转录本患者的CMR持续时间延长(2年持续CMR率:低水平为100%，高水平为37.5%，p=0.032;图2A)。然而，从第一次CMR的第一天到MR^4.5损失的第一天，两组之间没有显著差异(2年持续MR^4.5的比率:低水平100%vs高水平75.0%，p= 0.186;图2B)。

图2，Kaplan Meier图表。(A)*分子反应持续时间取决于用ddPCR检测BCR/ABL1转录水平(中位数：3.6拷贝/20 μL)。(B) qRT-PCR未检测BCR/ABL1到MR^4.5缺失的周期。IS是:国际规模,MR^4.5:4.5 log减少时的分子反应，ddPCR：液滴数字聚合酶链反应，qRT-PCR：实时定量聚合酶链反应。

表Ⅲ.随访期间CMR丧失的趋势。

讨论

MRD被认为在各种癌症中非常重要，因为治疗后低或阴性MRD与较长的反应持续时间和生存期相关，而DMR的成功预测了CML患者更好的临床结果。由于戒断临床研究(即STIM和TWISTER研究)的显著结果，适当选择阳性CMR患者对于预测无治疗缓解的成功非常重要。目前，qRT-PCR是监测TKI反应和MRD以及预测早期复发的主要方法。qRT-PCR虽然相对敏感，但由于标准化程度低、劳动强度大，存在一些局限性。克服这些限制，最近新兴技术，如下一代测序、下一代流和ddPCR，已经应用于精准医疗。其中，ddPCR是一种*的方法，其结果与qRT-PCR有很强的相关性。ddPCR可以在不需要参考标准曲线的情况下测量绝对拷贝数。此外，它可以检测灵敏度超过10^-6的核酸，受抑制物质、非靶RNA和非特异性扩增的影响较小。由于这些优点，ddPCR在癌症研究中已被用于评估循环肿瘤DNA、突变和肿瘤负担。ddPCR也被用于检测血液系统恶性肿瘤的MRD和预测预后。因此，ddPCR可能是qRT-PCR的最佳替代方式，然而，ddPCR的缺点，包括它的高成本，时间密集，和有限的数据在临床设置，必须解决，以使其更广泛的应用。

我们的结果表明，ddPCR可以作为qRT-PCR的补充，作为检测MRD的一个敏感工具。尽管qRT-PCR证实CMR状态(BCR/ABL1^IS =0%)，但所有患者均通过ddPCR检测到BCR/ABL1转录本。此外，我们注意到CMR的持续时间因MRD的不同而有显著差异，这与F实现CMR时的ddPCR检测结果一致。这一发现表明，低MRD是维持较长缓解期的重要因素，与以前的研究结果一致。然而，由于我们所有的患者在使用TKIs治疗期间都维持了主要的分子反应，因此，ddPCR检测到的BCR/ABL1转录水平升高是否作为治疗失败的临床意义尚存疑问。此外，由于尼洛替尼的治疗反应较好，大约80%的细胞遗传学*缓解率，所有患者在随访期间可能保持最佳缓解。因此，为了评估长期结果，可能需要进一步的随访。本研究的另一个局限性是我们不能常规使用ddPCR每3个月进行反应监测。由于ddPCR尚未广泛商业化，ddPCR的频繁使用受到限制。另外，一些患者根据输入RNA的结果不均匀，这也是另一个限制。利用ddPCR定量检测BCR/ABL1的标准尚未确立。因此，有一个协调一致的努力，以获得精确的结果与更少的假阳性液滴(例如，使用足够的cDNA体积)。然而，先前的一项研究表明，即使使用健康的捐赠者，假阳性率也可以达到2%。因此，为了提高ddPCR的敏感性，需要进一步规范和验证方案。

我们研究的另一个局限性是，尽管这是一个多机构的研究，但样本量小。因此，需要一项大规模的研究来证实这些结果。尽管有这些局限性，但据我们所知，这是第一个报道CMR状态的CML患者中，根据ddPCR测量的BCR/ABL1转录水平，结果存在差异的研究。总之，我们证明了在CML患者中使用ddPCR检测无法检测到BCR/ABL1转录本时的MRD的敏感性，正如qRT-PCR所测量的那样。此外，CMR持续时间因MRD的不同而有显著差异。要将ddPCR广泛应用于监测治疗反应和MRD检测，还需要进一步的大规模试验和严格验证。

结论